什么是RNA-seq技术?原理是什么?

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RNA-seq及RNA测序,又称转录组测序,就是把mRNA、smallRNA和no-codingRNA全部或者其中部分用高通量测序技术进行测序分析的技术。

技术原理:首先,我们获得细胞总RNA,然后根据实验需要,比如是需要测mRNA,ncRNA还是smallRNA等,对RNA样品进行处理。处理好的RNA再进行片段化,然后反转录形成cDNA,获得cDNA文库,然后在cDNA片段的两端接上接头,最后用新一代高通量测序依进行测序。

相对于传统的sanger测序法,RNA-seq具有以下优势:
1、数字化信号:直接测定每个转录本片段序列,单核苷酸分辨率的精确度,同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。
2、高灵敏度:能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。
3、任意物种的全基因组分析:无需预先设计特异性探针,因此无需了解物种基因信息,能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因,发现新的转录本,并精确地识别可变剪切位点及cSNP,UTR区域。

技术应用:
1、转录本结构研究
利用单碱基分辨率的RNA-Seq技术可极大地丰富基因注释的很多方面内容, 包括 5′/3′边界鉴定、UTRs区域鉴定以及新的转录区域鉴定等。RNA-Seq还可对可变剪接(Alternative splicing)进行定量研究。
2、转录本变异研究
在发现序列差异方面,如融合基因鉴定、编码序列多态性研究等,RNA-seq也具有很大的潜力。
3、非编码区域功能研究
转录组学研究的一个重要方面就是发现和分析ncRNA。
ncRNA按其功能可分为看家ncRNA和调节ncRNA。前者通常稳定表达,发挥着一系列对细胞存活至关重要的功能, 主要包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核 RNA(snRNA)及小核仁 RNA(snoRNA)等;后者主要包括长链 ncRNA(lncRNA)和以microRNA为代表的小ncRNA(small ncRNA), 在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因表达。
4、基因表达水平研究
相比于传统的芯片技术,RNA-Seq技术能更准确地确定细胞中RNA的表达水平。原则上,RNA-Seq有可能确定细胞群中的每一个分子的绝对数量,并对实验之间的结果进行直接比较。RNA-Seq一个特别强大的优势是它可以捕捉不同组织或状态下的转录组动态变化而无需对数据集进行复杂的标准化。
5、低丰度全新转录本的确定
虽然利用转座子标签和芯片技术能够获得全新的转录本,但是其工作量大,结果不确定。而RNA-Seq不受背景噪音问题的困扰,结果准确性高,因而被用来发现全新的转录本。近年来对酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、拟南芥、水稻、小鼠、人、和人体白色念珠菌的转录组测定结果都显示出大量的新转录区域,并且其中许多转录水平都低于已知的cDNA基因。

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RNA-seq即转录组测序技术,就是把mRNA,smallRNA,and NONcoding RNA等或者其中一些用高通量测序技术把它们的序列测出来。反映出它们的表达水平。

其原理是:首先获得细胞总RNA,主要包括 mRNA和非编码RNA ,然后根据实验需要,对RNA样品进行处理。处理好的RNA再进行片段化,然后反转录形成cDNA,获得cDNA文库,然后在cDNA片段的两端接上接头,最后用新一代高通量测序依进行测序,就能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息。

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RNA-Seq(RNA sequencing) 即RNA测序又称转录组测序,就是把mRNAsmallRNA和non-coding RNAncRNA全部或者其中一些用高通量测序技术进行测序分析的技术。转录组是指特定组织或细胞在某一发育阶段或功能状态下转录出来的所有RNA的总和, 主要包括mRNA和非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点是解读基因组功能原件和揭示细胞及组织分子组成所必需的。
原理:首先获得细胞总RNA然后根据实验需要,比如是需要测mRNA,ncRNA还是smallRNA等,对RNA样品进行处理。处理好的RNA再进行片段化,然后反转录形成cDNA,获得cDNA文库然后在cDNA片段的两端接上接头最后用新一代高通量测序依进行测序。
相对于传统的sanger测序法RNA-seq具有以下优势:
1、数字化信号直接测定每个转录本片段序列,单核苷酸分辨率的精确度同时不存在传统微阵列杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。
2、高灵敏度能够检测到细胞中少至几个拷贝的稀有转录本。
3、任意物种的全基因组分析无需预先设计特异性探针因此无需了解物种基因信息能够直接对任何物种进行转录组分析。同时能够检测未知基因发现新的转录本并精确地识别可变剪切位点及cSNPUTR区域。

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